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用PCR技術檢測水中隱孢子蟲

文件大小:0.12MB 格式:pdf 發布時間:2012-09-29 瀏覽次數:
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【中文關鍵詞】 隱孢子蟲卵囊  巢式PCR  免疫磁珠分離  免疫熒光分析    
【摘要】 介紹了一種檢測水中隱孢子蟲的巢式PCR方法:根據Cryptosporidiumparvum18srRNA基因序列選用了兩對引物,特異性擴增了該基因可變區中1056bp和435bp目標片段。
【部分正文預覽】

一 般情況下 ,隱孢子蟲卵囊在水體中的數量 比較少 ,但由于其引起感染的劑量很小 ,因而需要建立非常靈敏的檢測方法。檢測水體中的卵囊首先須從水中濃集卵囊 ,一般采用絮凝沉淀、膜濾、濾筒過濾或連續流離心等方法 ,水樣體積一般在 10~1000L之間 ,濃縮物中包括大量殘渣 ,如土壤顆粒 、植物碎片和藻類等。第二步是將卵囊從雜質中分離出來 ,常采用的方法有浮選 、密度梯度離心 、流式細胞儀分選和免疫磁珠分離等。最后是采用直接或間接顯微鏡檢法觀察和計數。

美國 EPA曾在 1996年提出了飲用水中隱孢子蟲的免疫熒光分析方法 (IFA),稱 為 1622方法 ,該方法 目前在國內外應用廣泛 ,然而此方法工作量大 、耗時長、回收率差異較大。

為克服免疫熒光分析的不足,近幾年來 ,國外在利用分子方法檢測水樣中的隱孢子蟲方面進行了許多嘗試-1],目前國內尚未見相關報道。PCR方法特異性強、靈敏度高 、不依賴人為因素,可同時批量處理樣品,通過選用不同引物可準確鑒定隱孢子蟲種屬,可區分卵囊的死活,是 目前該領域的研究熱點。該試驗根據 C.parvum基 因組序列,選用兩對引物 ,利用巢式 PCR特異性擴增隱孢子蟲 18srRNA基因可變區 1056bp和 435bp目標片段,利用直接接種加標的方法研究檢測靈敏度。

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